南湖新闻网讯（通讯员 李响 李金山）近日，国际知名学术期刊Molecular Plant以“BRIF-seq: bisulfite-converted randomly integrated fragments sequencing at single cell level”为题在线发表了我校玉米研究团队最新研究成果，团队开发了一种能广泛应用于不同物种组织、不依赖于DNA甲基化状态的单细胞DNA甲基化测序技术。博士后李响及博士生陈露是该研究的并列第一作者，严建兵教授和李青教授为共同通讯作者。

5甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine, 5mC) 是一种常见的DNA修饰类型，能调节基因表达、转座子及染色体的状态等。科学家利用单细胞重亚硫酸盐测序技术（single cell Bisulfite sequencing, scBS-seq）在人的生殖细胞、胚胎细胞和神经细胞中检测到大量的DNA甲基化异质性，这对于理解生殖发育及疾病防治有重要的意义。同样，在植物中鉴定甲基化的细胞异质性也有很大价值，但在植物中进行单细胞DNA甲基化测序还是极具挑战的。一方面，细胞壁的存在使单细胞难以分离，另一方面，特别是对于高甲基化高重复度的基因组来说，经重亚硫酸盐转化后的DNA片段也很难被用于建库及测序。原因可能是，重亚硫酸盐处理DNA时，非甲基化的胞嘧啶除了有可能转化成尿嘧啶外，也有很高几率发生脱嘧啶作用进而形成无碱基位点。含有大量重复序列的高甲基化基因组在重亚硫酸盐处理DNA时，就可能会产生很长的非脱碱基片段，再经过scBS-seq方法的片段扩增后，最终产生较长的文库片段。综上，scBS-seq的扩增方法可能并不擅长处理高甲基化高重复度基因组。

为此，李响博士发明了新的扩增方法bisulfite-converted randomly integrated fragments sequencing (BRIF-seq)。相对于scBS-seq的扩增策略，即直接将第一步扩增的小片段加上接头用于测序，BRIF-seq方法的不同之处在于将随机扩增产生的小片段进行了单链连接、MDA扩增及基于Tn5的建库步骤。 这些步骤保证了各种长度的转化片段都能进入文库用于测序。由于BRIF-seq的建库步骤包含单链DNA片段的连接，所以测序的读段很可能会包含两个不同位置的片段。为此，博士生陈露开发了方法，快速地剪切读段，使不同来源的连接片段都能比对回基因组，达到数据最大化利用的目的。

结果证明，利用scBRIF-seq产生的读段比scBS-seq有更高的比对率和基因组覆盖度。对于玉米的单个小孢子，获得75 million的比对读段能达到最高效的基因组覆盖度（35%）；持续增加测序数据量，覆盖度也能增加到41.8%。此外还发现，比起scBS-seq，scBRIF-seq的读段确实能覆盖更多的高甲基化区段，故scBRIF-seq是一种更无偏地覆盖基因组，且不依赖于DNA的甲基化水平的方法。所以理论上，高比对率高覆盖度的BRIF-seq方法能被广泛的应用于不同物种、不同组织、不同甲基化水平的细胞。

通过scBRIF-seq，研究者鉴定出玉米的四分体之间存在明显的DNA甲基化水平差异，而同一个四分体的四个小孢子间却没有显著的甲基化水平差异。细胞间的异质性位点也被鉴定出来。这些结果说明玉米的雄配子体发育过程中存在剧烈的甲基化重编程和巨大的细胞异质性，玉米作为作物模式生物，值得进一步研究。在各物种中，也有很多生物学现象需要通过鉴定细胞异质性来解析机理。现在BRIF-seq为不同物种提供了一个相对无偏的单细胞DNA甲基化检测方法。

相关链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205219300097

审核人：赵小剑